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免疫熒光實驗的要領你可記清楚了？

發(fā)布時間： 2023-06-28　　點擊次數(shù)： 1237次

　　免疫熒光實驗是一種廣泛應用于生物醫(yī)學研究領域的實驗技術，它通過利用熒光標記的抗體來檢測樣本中特定蛋白質的存在和表達情況。原理基于抗體-抗原相互作用的特性。在該實驗中，首先需要將待檢測樣品中含有的目標分子（如蛋白質）與對應的抗體進行結合，形成抗原-抗體復合物。然后，使用熒光標記的次級抗體與該復合物結合，從而標記出目標分子的存在位置和數(shù)量。
　　免疫熒光實驗的技巧：
　　1、細胞準備。對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次;對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞，用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。
　　2、固定。根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎?。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5min.
　　3、通透。使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5min.
　　4、封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min.
　　5、一抗結合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.
　　6、二抗結合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。
　　7、封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

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